Isabella là con thứ và là con gái lớn nhất của Quốc vương Bồ Đào Nha Manuel I với Maria xứ Aragon. Bà được đặt tên theo bà ngoại Isabella I của Castilla và người dì Isabella xứ Aragon, Vương hậu Bồ Đào Nha.

Isabella đứng thứ hai trong danh sách kế vị ngai vàng Bồ Đào Nha cho đến khi em trai bà được sinh ra, Louis. Tuy nhiên, vì là con gái cả của Manuel I, bà là một ứng cử viên hôn nhân sáng giá. Bà kết hôn với anh họ Carlos, con trai của Juana của Castilla với Philip I của Castilla. Cả Carlos và Isabella đều là cháu ngoại của hai nhà cai trị kiệt xuất Ferdinand và Isabella I của Tây Ban Nha.